Cariotipo molecolare/Array-CGH

Il cariotipo molecolare, noto anche come analisi array-CGH, è una metodica d’indagine basata sull’ibridazione comparativa del genoma basata su array (array-based Comparative Genomic Hybridization). Tale indagine ha il fine di identificare alterazioni del DNA note come variazioni del numero di copie, che non sono rilevabili con altre tecniche di citogenetica convenzionale.

Le variazioni del numero di copie possono essere delezioni, cioè perdite di porzioni di genoma, o duplicazioni/amplificazioni che consistono nella presenza di copie in eccesso di segmenti di DNA.

Queste anomalie del DNA possono essere la causa di diverse patologie costituzionali, come le sindromi associate a ritardo mentale, le sindromi malformative, i disturbi neurologici (es. autismo ed epilessia) e di diverse patologie tumorali.

Negli anni l’avvento di nuove tecniche di citogenetica molecolare ha permesso di incrementare la possibilità di evidenziare riarrangiamenti cromosomici sbilanciati di dimensioni inferiori a quelli visibili con le tecniche di citogenetica convenzionale.

Il cariotipo molecolare ha una risoluzione molto elevata (100-1000 volte) rispetto al cariotipo convenzionale, consentendo quindi l’identificazione di variazioni del numero di copie di piccole dimensioni, anche di poche centinaia di paia di basi, e la conseguente scoperta di nuove sindromi da microdelezione e microduplicazione. 
Inoltre l’array-CGH permette di definire esattamente la regione genomica alterata e quindi anche i geni in essa contenuti, migliorando la comprensione delle relazioni esistenti tra le anomalie del DNA e la patologia del paziente esaminato.

Il cariotipo molecolare consente quindi un notevole incremento della possibilità di raggiungere una diagnosi certa.

L’array-CGH viene prevalentemente utilizzato per la diagnosi postnatale di fenotipi complessi associati a ritardo mentale di grado variabile. Il cariotipo molecolare trova impiego anche come tecnica diagnostica di secondo livello nella diagnosi prenatale. I limiti di tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dall’impossibilità di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati e mosaicismi con una linea cellulare scarsamente rappresentata (inferiore al 20%).

La tecnologia microarray rappresenta oggigiorno uno strumento fondamentale per il raggiungimento di una corretta diagnosi di laboratorio per diverse malattie genetiche.


Applicazioni

Diagnosi prenatale

Diagnosi prenatale

Diagnosi postnatale | Genetica Medica

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Principio della tecnica

Il principio della tecnica array-CGH si basa sulla comparazione quantitativa del DNA dell’individuo da testare (“DNA test”) con un DNA di controllo (“DNA reference”), solitamente ottenuto da un soggetto sano.

Durante il processo analitico entrambi i DNA vengono “marcati” con due sostanze fluorescenti di colore diverso (generalmente si utilizza un fluorocromo rosso il DNA da testare ed un fluorocromo verde per il DNA di controllo). I due DNA marcati vengono mescolati in parti uguali e, dopo una opportuna purificazione, ibridati sulla piattaforma array (supporto di vetro o plastica la cui superficie è coperta da frammenti di DNA comunemente chiamati “sonde”). Dopo opportuni lavaggi post-ibridazione, la piattaforma viene sottoposta a cattura digitale delle immagini tramite uno scanner in grado di misurare l’intensità dei segnali fluorescenti emessi dalle sonde.

Ogni sonda della piattaforma rappresenta una specifica regione del genoma umano e, tanto più è elevato il numero di sonde, maggiore è l’efficacia dell’array nell’identificazione delle variazioni del numero di copie. Misurando con un scanner le intensità di fluorescenza emesse dai DNA ibridati sull’array e comparandole tra loro, è possibile evidenziare variazioni del numero di copie presenti nel DNA test.

Attualmente sono disponibili diverse tipologie di piattaforme array-CGH. Queste possono essere suddivise in due categorie principali, a seconda del tipo di sonde presenti sull’array: “BAC-arrays” e “oligo-arrays“.

I BAC-arrays, considerati arrays di vecchia generazione, contengono un numero piuttosto limitato di sonde che, a causa delle loro dimensioni (circa 160.000 paia di basi), danno una minore specificità e una minore risoluzione.

Gli oligo-arrays hanno invece un numero molto più elevato di sonde di piccole dimensioni (da 20 a 100 basi) con un’elevata specificità che garantiscono una risoluzione molto alta.

Numerose pubblicazioni scientifiche hanno evidenziato i significativi vantaggi che si ottengono utilizzando gli oligo-arrays, i quali consistono essenzialmente in una risoluzione molto più elevata, maggior accuratezza nella definizione delle anomalie del DNA e una notevole riduzione dei risultati falsi positivi e falsi negativi.


Vantaggi dell’Array-CGH

L’analisi array-CGH, o cariotipo molecolare, presenta molti vantaggi rispetto ad altre tecniche di citogenetica convenzionale, come il cariotipo convenzionale o la tecnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridation).

Il cariotipo convenzionale, pur essendo una tecnica in grado di individuare diverse anomalie cromosomiche, numeriche e strutturali, è limitato nelle sue possibilità diagnostiche dal potere di risoluzione di questa indagine. Il cariotipo convenzionale potrebbe quindi risultare normale qualora la delezione/duplicazione presente nel soggetto con fenotipo patologico (paziente con ritardo mentale, autismo, epilessia, etc…) sia di dimensioni inferiore al limite di risoluzione del cariotipo (circa 10Mb).

La tecnica FISH è un’altra metodica che consente di evidenziare riarrangiamenti in specifiche regioni genomiche. La FISH è generalmente utilizzata per “indagini mirate” basate su una specifica indicazione clinica. Ciò limita l’applicazione di questa tecnica in quanto in molti casi i fenotipi patologici non sono riconducibili a sindromi note.

L’analisi array-CGH consente invece di analizzare l’intero genoma in un unico test e con una risoluzione molto elevata, evidenziando eventuali anomalie cromosomiche presenti a livello dell’intero DNA genomico.,

Il cariotipo molecolare può essere utilizzato anche in assenza di una specifica diagnosi clinica o di un sospetto diagnostico aumentando notevolmente l’applicabilità di questo test e, di conseguenza, la probabilità di diagnosticare correttamente le patologie associate ad anomalie cromosomiche.

Per tali motivi, il cariotipo molecolare è considerato attualmente il test genetico di primo livello per la diagnosi di sindromi genetiche con ritardo mentale, malformazioni congenite e disordini neurologici.

Rispetto ad altre metodiche di indagine, come il cariotipo convenzionale, l’array-CGH ha una risoluzione molto più elevata (100-1000 volte), consentendo quindi l’identificazione di variazioni del numero di copie di piccole dimensioni, anche di poche centinaia di paia di basi, e la conseguente scoperta di nuove sindromi da microdelezione e microduplicazione. Inoltre il cariotipo molecolare permette di definire esattamente la regione genomica alterata e quindi anche i geni in essa contenuti, migliorando la comprensione delle relazioni esistenti tra le anomalie del DNA e la patologia del paziente esaminato.

L’analisi array-CGH garantisce quindi un notevole incremento della possibilità di formulare una diagnosi certa.

In aggiunta, l’analisi array-CGH, a differenza del cariotipo convenzionale, non necessita di colture cellulari; ciò permette di ridurre i tempi di refertazione a 3-5 giorni qualora l’analisi assuma carattere d’urgenza come, ad esempio, l’indagine del cariotipo molecolare in diagnosi prenatale.